环境模拟与污染控制国家重点联合实验室  北京师范大学环境学院  史江红

       天然雌激素雌酮（Estrone，E1）、雌二醇（17β-Estradiol，E2）、雌三醇（Estriol，E3）和人工合成雌激素乙炔基雌二醇（17α-Ethinyl Estradiol，EE2）是最具潜在雌性化风险的内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Compounds，EDCS），随人和动物的排泄物进入环境中。在具备污水处理设施的区域，人类通过粪尿排放的雌激素，经过下水管道和污水处理厂，尚未去除的雌激素会随着污水处理厂出水进入到水体、农田、土壤等环境中；畜禽粪便中的雌激素亦会通过堆肥发酵处置后进入农田土壤中。污水处理厂出水和农田径流是雌激素进入河流和湖泊等水体的主要途径。失去雌激素活性的雌激素葡萄糖苷酸和硫酸盐结合体在排往污水处理厂之前或在污水处理厂中大部分复原为雌激素。现有的污水处理厂处理工艺往往不能有效去除原水中的雌激素，导致出水及受纳水体中雌激素被检出，其浓度为ng/L至几十ng/L。所以污水处理厂出水排入水体，导致水环境中含有ng/L水平的雌激素。

       雌激素虽然在水环境中的浓度仅为ng/L水平，但却是引起鱼类雌性化的主要原因物质，会对鱼类、贝类、鸟类等动物产生雌性化、体数减少、精巢异常等生殖异常化现象以及潜在的人类生殖健康问题。80年代在英国泰晤士河接纳污水处理厂出水的下游河段中，发现雌雄同体的鲤鱼；随后的有关鱼类生殖异常现象的研究结果表明，雄性的虹鳟鱼放入污水处理厂出水中3个星期之后，出现雌性化现象，证明了ng/L水平的E2、 EE2及 E1可以导致雄性虹鳟鱼的雌性化。一些研究表明，河中鱼类雌性化的原因主要是污水处理厂出水中含有的EE2，E2，E1所导致的。鱼类的vitro毒理实验研究结果表明，雌激素效应大小顺序为EE2>E2>E1。

       由于雌激素排放不可避免，因此提高污水处理系统中雌激素去除效率是减少或控制雌激素进入水环境的重要措施。针对污水处理系统中污水和污泥，建立雌激素高回收率和低成本的分析检测技术，进一步研究其在污水处理系统中的浓度分布特征、雌激素在泥水相间的迁移转化过程、生物降解特性以及影响雌激素去除效果的工艺参数等，可以为今后污水处理系统中雌激素的去除措施以及排放标准等相关管理工作提供学术依据和技术支撑。

       污水及污泥中基质组成复杂，而雌激素在这些介质中又痕量存在，使得雌激素在仪器分析时较容易受到基质干扰作用。因而污水和污泥中雌激素的提取和净化步骤显得尤为重要。

1.1     污水和污泥样品的前处理

       对于基质组成复杂的污水，在固相萃取前必须用玻璃纤维滤膜过滤，防止堵塞SPE柱，滤膜的孔径多选择0.45μm、0.7μm、1.0μm等。过滤后一般会调节水样pH值至2~3，其目的是为了抑制微生物活性，使目标物在水相中以分子态存在，便于后续固相萃取柱的富集。此外，由于污水中含有天然有机质（Natural organic matter，NOM），使得雌激素可能被吸附在这些NOM上，导致水样分析结果偏低。为了降低NOM等对水中目标化合物的吸附，可以在水样富集前添加1%~5%的水溶性有机溶剂，如甲醇或异丙醇，可以降低NOM对目标化合物的吸附。污泥样品采集后迅速加入叠氮化钠溶液对污泥进行稳定化处理，可有效降低微生物活性，避免雌激素被降解或者E2转变为E1。许多文献建议使用冷冻干燥、高压蒸汽灭菌等方式来保存样品。

1.2    污水和污泥样品的提取和净化

       根据污水中被测物质的浓度范围，污水富集体积从100ml~2000ml不等。污水样品的富集多采用固相萃取柱（SPE柱）中的亲水-亲酯平衡的Oasis HLB柱或反相C18柱，其中HLB柱应用最广泛。富集完成后，再用特定极性的有机溶剂将目标物从SPE柱上洗脱下来。常见的HLB柱洗脱溶剂包括乙酸乙酯、甲醇、甲醇/甲基叔丁基醚（10/90，V/V）、甲醇/水（50/50，V/V）、甲醇/二氯甲烷（50/50，V/V）等。

由于污水厂进水相比污水厂出水或河水中的有机质含量要高，有时富集洗脱后仍存在较多杂质而影响仪器测定，这时就需要对洗脱液进行进一步净化。常用的净化用SPE柱包括Florisil柱、Silica柱和NH₂柱等，这些柱子可以串联在HLB柱后使用，也可以单独对洗脱液进行净化。Florisil属于正相柱，适用于从非极性萃取液中吸附极性化合物，如胺类、羟基类及含杂原子或杂环化合物，能够实现大多色素及腐植酸大分子的去除；NH₂柱一般用于雌激素结合体的分离；Silica柱非常适合用来分离结构相似的弱极性化合物。

       污泥自身组成的复杂性和雌激素在污泥中的痕量存在而直接影响了污泥中雌激素的准确定量。污泥中雌激素的测定一般包括样品稳定、提取、净化和最终定量几个步骤。前处理污泥样品的使用量也是影响污泥中痕量雌激素回收率的重要因素，文献报道的样品使用量大多在0.1~1g之间。有机污泥中雌激素的定量分析需要高效且选择性地从基质组分中提取目标化合物。传统的提取技术如索氏提取、超声、旋转摇动等，曾经用于从污水处理厂的污泥样品中提取雌激素化合物。但是由于雌激素化合物的中度疏水性，溶剂萃取过程常用非极性和非质子性极性有机化合物，如正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙酸等，所以传统提取技术的主要缺点在于费时且耗费大量溶剂。近些年来，加速溶剂萃取（ASE）越来越多地应用于污泥中雌激素的提取。ASE通过对萃取池加压来实现高温，通过降低粘度和增加溶剂的扩散系数而破坏目标分析物与基质间的相互作用。而且高压能增强溶剂穿透力，从而提高提取效率。微波辅助提取（MAE）在一些文献中也曾用于雌激素的提取，MAE与传统提取方法相比，具有溶剂耗费少、省时且能同时提取多组分等优点。

       文献报道碱性溶液可以溶解提取残渣中的EE2并使之离子化，有利于进一步衍生化；碱性的氢氧化钠溶液可以从氯仿中高回收率的提取E2。这是因为在碱性条件下雌激素可以解离成离子，增大了溶解度。相反，中性或碱性有机物的溶解度会由于盐析作用而减小。针对复杂基质下污水和污泥基质，我们课题组尝试将碱液提取结合SPE净化，从雌激素分析结构及其理化性质入手，联合并充分发挥多种净化方法的优点，开发出一种更加简便、净化效果更好的雌激素前处理方法，建立了高回收率和消除基质干扰的多种物质的共检测技术，应用于基质复杂环境样品的净化。

1.3     仪器分析

       分析仪器的快速发展，给许多环境中痕量或超痕量存在的有机化合物分析提供了技术保障，雌激素的仪器分析最常用的是LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS。GC-MS或GC-MS/MS分析前需要对样品进行衍生化，其最低检测限（LOD）一般都在1ng/L以下。近些年LC-MS/MS由于灵敏度高、检出限低，应用更加广泛。但LC-MS/MS分析时更容易受到基质的干扰作用，样品的前处理尤为关键。

       雌激素在各个国家的污水厂中均有检出，其中E1、E2和E3的浓度多为几ng/L至上百ng/L。例如，英国的七家污水处理厂出水中，1~50 ng/L的E2、1~80 ng/L 的E1和0.2 ~7.0 ng/L的 EE2被检出。由于结合体会在环境中发生脱结合体作用形成具有雌激素活性的自由体，目前对结合体的研究报道逐渐增多。现有研究显示，雌激素结合体占到污水处理厂总雌激素负荷的高达60%。根据实验室的降解实验研究，脱结合体作用主要发生在葡萄糖苷酸结合体，而硫酸盐结合体较为不易产生脱结合体的作用，因此污水中雌激素结合体多为硫酸盐结合体，但研究亦发现葡萄糖苷酸结合体在污水原水中被检出，浓度在20 ng/L以内。

       污水进入一级处理装置沉砂池或沉淀池后，由于雌激素自由体的log K_ow较高，很容易被吸附到固体物质中去，但是很多研究表明，在这个阶段，雌激素没有明显被去除，不同污水处理工艺对雌激素的降解效果不同。强化一级处理（添加FeCl₃）对E1和E2的处理效率仅为14%和5%，而在进水条件相似的情况下，使用“SBR-微滤-反渗透”的处理工艺，对E1和E2的处理效率提高到了85%和96%。一家位于德国的脱氮除磷工艺污水处理厂，经过初次沉淀池-反硝化池-硝化池-二次沉淀池处理后，污水中的E1、E2和EE2的去除率分别为大于98%、E2和大于90%。Hashimoto等比较了传统活性污泥法和强化氧化沟法对雌激素的处理率，发现强化氧化沟法对E1和E2的处理率（76%~87%和93%~95%），高于传统活性污泥法（41%~71%和85%）。Zorita等对瑞典污水处理厂中雌激素去除效果研究后发现，化学处理可使55%~70%的雌激素被去除，沙滤显著调高了雌激素的去除率，达到了90%以上。Zhou等对北京市三个污水处理厂进行调查，显示E1、E2和E3的去除率分别为82.7%、68.4%和94.9%。Nie等对中国的一家应用A²/O脱氮除磷工艺的污水处理厂污水中的雌激素进行了检测，发现E2、E3和EE2的去除率都达到了90%以上，E1的去除率为75.4%。可见，脱氮除磷活性污泥工艺对雌激素具有较好的去除效果。

       目前，脱氮除磷活性污泥法研究重点在于如何提高脱氮除磷效果，尚未系统研究在脱氮除磷处理过程中内分泌干扰物的生物降解特性。因此，如何强化脱氮除磷工艺对雌激素的降解效率是需要解决的科学问题。脱氮除磷污水处理系统中雌激素能否被微生物有效降解？影响其降解效率的主要因素有哪些？脱氮除磷污水处理系统中雌激素的分布规律和迁移转化过程是什么？能否提出即能保证出水氮磷达标又能保证雌激素有效去除的工艺优化参数组合？针对上述问题，我们探讨分析了雌激素在分段进水A/O工艺中的去除和脱氮除磷的关系，在分段进水A/O污水处理小试装置处于高脱氮或高除磷状态下，考察了E1和E2的浓度沿程分布规律及其去除特征的差异性，希望为提高污水处理系统中雌激素的去除率，优化工艺操作参数提高研究基础。

       与污水相比，污泥中雌激素的研究受到的关注较少。污泥主要通过厌氧消化、好氧稳定化或化学处理（添加石灰）进行处理。Andersen等和Ternes等的研究发现，污泥厌氧消化的过程中，在产甲烷菌存在的条件下，雌激素几乎没有被降解。Czajka 和Londry的实验室研究也发现，在厌氧条件下，污泥中的E2主要转化为E1，E1仅仅降解了17%，EE2在一年后仍没有被降解。然而，在Carballa等进行的厌氧中试反应器中，却记录到了E1、E2和EE2的85%被降解，这也许与较长的污泥停留时间（SRT=10-30d）有关。据Nieto等的报道，污泥中E3的浓度高达272~406μg/kg·dw，污水中E3的去除率较高，也说明部分E3是被污泥吸附，由水相转移到了泥相。

       Ternes等报道，在通常的活性污泥处理系统中，E2和E1能够得到一定程度的生物降解，但是EE2基本不被分解，显示活性污泥中的某些微生物担当一定的降解E2、E1的作用。Vader等报道硝化污泥可以降解EE2，但是未说明硝化污泥是否可以降解天然雌激素。Lee 等发现活性污泥可以降解E2为E1，E1降解为其他代谢产物的降解途径。Colucci等报道 E2、E1和EE2能够很快被农田土壤中的某些微生物降解。史等报道硝化污泥不仅可以降解EE2 而且可以降解E1、E2和E3，降解反应为一级动力学反应，其中E2的降解速度最快；E2先被降解为E1，然后E1再被降解为其他产物；推定出硝化污泥对E2的降解过程中的2种中间生成物；发现硝化污泥降解雌激素过程中，类雌激素活性亦逐步降低，降解实验末期样品中的类雌激素活性主要是由残留的雌激素所引起的。而Joss等的研究表明，在严格厌氧条件下，雌激素转化途径为E1转化为E2，而不是E2转化为E1。史等报道以雌激素作为唯一碳源，从牛粪堆肥中驯化筛选出EE2、以及 E2/E1的降解菌株HNS-1株-真菌类镰刀菌Fusarium proliferatum。Fujii 等报道，从活性污泥中驯化分离出E2的降解菌新鞘氨醇杆菌属Novosphingobium tardaugensn.sp。Yoshimoto 等报道从活性污泥中分离出马红球菌Rhodococcus zopfii和Rhodococcus equi（革兰氏阳性杆菌）可以降解E1、E2、E3和EE2。史等报道硝化污泥中的硝化细菌-欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonas europaea能降解E1、E2、E3和EE2，降解反应为零级动力学反应，4种雌激素的分解速度没有大的差异，E2的分解中未发现生成E1。从上述与硝化污泥不同的降解特征推断，硝化污泥中一定存在着硝化菌以外的雌激素降解菌。随后，从中驯化出了可降解EE2/ E2/E1的菌株FN-1株-红球杆菌Rhodococcus equi。Ke 等报道，从经超滤膜的二级处理出水处理的人造蓄水层沙土中分离出LHJ1、LHJ3和CYH菌株-Acinetobacter and Agromyces（琼氏不动杆菌和壤霉菌属），可以降解E1、E2、E3和EE2，推断出三种EE2降解产物，并探讨了雌激素结构上的转化途径。这些研究表明，活性污泥对雌激素具有降解作用，并且硝化污泥比普通活性污泥降解雌激素的能力更强。然而，关于污水处理过程中雌激素降解效率与处理工艺的关系以及生物降解机理等还鲜见报道。有必要进一步探索污水处理厂对雌激素的去除效率与去除过程，研究处理工艺与雌激素的去除效率的关系；尤其是如何强化目前广乏应用的活性污泥脱氮除磷工艺对雌激素的降解效率是亟待解决的科学与技术问题。

       对于雌激素在污水处理系统中的迁移转化及生物降解研究可概括为两个方面：

一方面是实验室条件下，利用不同污水处理系统中的污泥进行批次试验。由于雌激素具有较大的泥/水分配系数，污泥吸附作用也是雌激素从污水中去除的重要途径。天然雌激素在污泥中的吸附过程符合Freundlich吸附等温式，并且吸附过程很快就能达到平衡。Joss等提出E1、E2、EE2在污水处理系统里的迁移转化模式，包括了结合体转化为自由体生物过程、E1和E2相互转化过程，及其雌激素被污泥吸附的迁移分配过程。

       另一方面，利用实际或模拟实际污水处理系统装置，考察雌激素的迁移转化及其影响因素。污泥停留时间（SRT）、水力停留时间（HRT）越大的污水处理系统，其雌激素去除率也有增大的趋势。虽然这些研究结果，可以为实际污水处理厂提高雌激素去除率提供重要参考，但尚存在一些不足：实验室条件下进行的污泥降解与吸附实验中，通常投加雌激素的浓度比实际污水中的浓度要高，不能代表实际污水中雌激素的含量；现场采集并运回至实验室的活性污泥，在实验室培养条件下其特性也会发生变化，其污泥降解能力和吸附能力均有一定的改变；考察实际污水处理厂时，虽然直接获取了最有指导意义的数据，但是不能根据试验条件而自由改变工艺参数，故具有很大的局限性；此外，目前进行模拟试验时用的多为人工配水，但实际污水要比这复杂得多。因此，有必要进一步探讨真实污水条件下雌激素在污水处理装置中的迁移转化规律。

       A/O工艺是80年代提出的前置反硝化生物脱氮系统，但由于该工艺需要外加有机碳源和补充碱度等缺陷，有专家提出了分段进水A/O脱氮工艺。该工艺反应体积小，无需内回流，具有较高的脱氮能力，因此广泛适用于要求深度脱氮的污水处理厂设计和改扩建中。多级A/O工艺特征决定了工艺操作和控制的复杂性，其进水分配比及缺、好氧体积比等工艺操作条件，往往需要较长时间的实际工艺运行、优化才能处于较佳状态。一些研究探讨了操作参数对多级A/O工艺净水效果的影响，来寻求较佳工艺参数值。史等利用具有较好脱氮能力的分段进水A/O污水处理小型试验装置，对实际的城市生活污水进行处理；并基于Stella 9.0.1软件建立了分段进水A/O小试的ASM3水处理模型，可以用来考察在不同的工艺操作条件下，各段水相和污泥相中雌激素的浓度变化，探讨雌激素在分段进水A/O工艺中的迁移转化规律。

       污水处理厂对雌激素的去除效果受多种工艺条件参数的影响，例如微生物活性、污泥停留时间（SRT），水力停留时间（HRT）、温度、降雨以及好氧厌氧条件等。从以往的报道中可以发现，不同工艺的污水处理厂对E1、E2和EE2的去除率不同，这与污水处理工艺不同以及处理单元、工艺参数等有直接的关系。Lee等的研究表明，污水处理厂中雌激素的降解和迁移取决于污水处理厂的设计和运行参数。工艺操作参数的改变对污水处理系统运行状态影响很大，Suzuki等对英国污水处理厂的研究表明，较长的水力停留时间可以取得较好的E1、E2和EE2去除效果，水力停留时间为13h左右时，去除效果明显比2-5h要好。Svenson等调查了瑞典20座污水处理厂进出水中雌激素的浓度，其中，Kävlinge污水处理厂水力停留时间为20h，对雌激素实现了较好的去除效果。增加污泥停留时间可以明显的提高污水中雌激素的去除效率。Andersen等调查的一家冰岛污水处理厂由传统的活性污泥处理升级为脱氮处理，具有了较高的污泥停留时间，从<4d增加到11-13d，使污水中90%左右的EE2被去除。增大污泥龄可以使高污泥龄的氨氧化细菌生长，从而在高SRT处理工艺条件下实现雌激素高去除率效果。

       我国尚缺乏相应的污水处理厂出水雌激素水质标准，英国污水处理厂出水雌激素的建议标准为雌激素总浓度（[E1]/3+E2+10[EE2]）小于或等于1ng/L。为迎接未来我国雌激素出水水质标准的建立或颁布，需要针对我国污水处理现状，开展水处理工艺的优化组合或新型处理工艺的研发工作。

       进一步开展示范性工程现场试验研究，提高脱氮除磷处理工艺中雌激素等有毒有害痕量有机物的的去除效果，系统性考察不同工艺运行状态下这些物质的去除、浓度分布特征和脱氮除磷的关系，深入探讨HRT、SRT等工艺参数对雌激素去除效率的影响，寻找即具有高效脱氮除磷效率又能够提高这类污染物去除率的污水处理工艺及其参数。